α-淀粉酶是一类可以将淀粉(或糖原)水解产生可溶性糊精、低聚糖和葡萄糖等的酶，能切断分子中的α-1,4-葡萄糖苷键，在食品、制药、造纸等行业有着广泛的应用。
现行的淀粉酶法制糖工艺过程主要包括糊化、液化和糖化，在淀粉液化过程中主要使用α-淀粉酶，糖化过程中使用糖化酶在内的多种水解酶。
淀粉的液化一般在95℃~105℃、pH值6.0下进行，如果采用喷射液化，喷射温度为105℃~110℃，喷射液化中更高的温度有利于蛋白质的进一步聚集，有利于提高淀粉利用率和糖液质量。
自1997年PFA的优良特性被发现以来，国内外很多学者致力于对它的研究。有研究者在嗜热古菌中建立了基因重组表达系统，但存在转化和培养困难等问题。
大肠杆菌表达系统虽研究成熟，但细胞周质内含有种类繁多的内毒素；解淀粉芽孢杆菌虽属于食品安全菌株，但表达载体构建复杂且不易转化；毕赤酵母是真核生物，与古细菌亲缘性较远。
枯草芽孢杆菌是一种被广泛应用的食品级安全宿主菌，其表达系统较成熟且发酵培养周期短，培养条件简单，适合大规模工业酶发酵生产。
枯草芽孢杆菌在工业酶生产中有着广泛的应用，被美国食品和药物管理局列为安全的微生物(GRAS)，具有遗传背景清晰、蛋白分泌能力较强、发酵培养简单等特点。
因此，利用枯草芽孢杆菌来高效表达超高温α-淀粉酶对该酶在淀粉制糖工艺中的应用具有更高的工业价值。
研究表明枯草芽孢菌分泌蛋白与信号肽之间具有特异的适配性，不同信号肽对同一蛋白的分泌效率差异显著。共表达胞外折叠原件可以有效提高宿主菌胞外分泌能力。
目前发现的枯草芽孢杆菌胞外伴侣蛋白PrsA是一种锚定于细胞质膜外侧的脂蛋白，辅助依赖于PrsA蛋白的折叠，减少蛋白酶对其中间状态的降解，从而使胞外表达量增加。
本研究构建了枯草芽孢杆菌信号肽筛选库，结合高通量筛选方法，筛选最优信号肽，共表达伴侣蛋白，进一步提高PFA在枯草芽孢杆菌中的表达。
最后对重组表达的PFA酶学性质进行探究，为其在淀粉酶法制糖工艺中的应用奠定基础。
菌种与质粒大肠杆菌JM109和pMDTM19-T载体由本实验室保藏；枯草芽孢杆菌WS9和含有PHpaⅡ-PamyQ双启动子的表达载体pHY300PLK由本实验室前期构建并保藏；用于信号肽筛选的枯草芽孢杆菌RIK1285和质粒pBE-S购于宝生物工程(大连)有限公司。
重组质粒pHY300PLK-pfa的构建及鉴定扩增产物经过琼脂糖凝胶DNA回收试剂盒处理后，连接转化大肠杆菌JM109，构成重组质粒pHY300PLK-pfa。采用HindⅢ单酶切质粒鉴定外源基因是否插入。
枯草芽孢杆菌感受态的制备与转化质粒采用化学转化法转入到枯草芽孢杆菌宿主，具体方法参照文献，将转化后的菌体立刻涂布于卡那抗性的LB固体平板上，倒置于37℃恒温培养箱中过夜培养。
重组超高温α-淀粉酶的表达接种重组到液体LB培养基中，转速为200r/min、37℃下过夜培养，按5%接种量转接到装有50mLTB培养基的250mL三角培养瓶中发酵培养，200r/min、37℃培养2h后，33℃下继续培养60h。
发酵完成后，收集胞外上清液，并对细胞进行超声破碎，进行后续酶活测定。
重组菌WS9-PFA的构建在载体上位于基因插入位点的上下游有两个HindⅢ酶切位点，采用限制性内切酶HindⅢ酶切质粒pHY300PLK-pfa，会得到大小分别为6000bp和2000bp的两条条带。
利用枯草芽孢杆菌化学转化方法，将重组质粒pHY300PLK-pfa转化到中。
接种重组菌WS9-PFA到含有四环素抗性(20mg/mL)的液体LB培养基中，在转速为200r/min、温度为37℃条件下培养10h。
然后按照2.5%的接种量转接到含有四环素(20mg/mL)的TB培养基中以相同条件继续发酵培养60h。
发酵结束后，对发酵上清液进行α-淀粉酶的活性检测，酶活为18.33U/mL；对浓度为5个OD值1mL菌体超声破碎，胞内酶活为11.9U/mL。PFA的蛋白是二聚体结构，100℃变性后为两条带。
信号肽筛选文库的建立和高通量筛选采用TaKaRa公司枯草芽孢杆菌信号肽筛选试剂盒进行信号肽的筛选。
筛选流程为：第一步是将目的基因与筛选载体pBE-S连接；第二步用173种不同信号肽来替换原有信号肽，构建信号肽筛选文库。
第三步将这些含有不同信号肽的重组筛选载体质粒转入筛选宿主中进行高通量筛选。在进行初筛和复筛后，选出最优表达的信号肽。
最后，把最优信号肽重组到表达载体pHY300PLK并转入表达宿主内进行重组表达。
首先利用无缝克隆的方式将基因pfa扩增后与PCR线性化的载体pBE-S连接，构建重组的筛选载体pBES-pfa。
采用限制性内切酶NdeⅠ和EcoRⅠ酶切质粒，得到大小分别为6000bp和1300bp左右的两个片段，结果表明构建成功，并对其进行测序，测序结果正确。
随后将测序正确的筛选载体质粒PCR线性化并与sp-Mix进行连接，构建带有不同信号肽的重组筛选载体文库。
由于转化效率高于，为了获得足够多的克隆子，先在宿主中进行高通量筛选。
初筛了1152个克隆子，根据96孔板检测结果，挑选了288个酶活较高的克隆子进行复筛。
复筛之后，再挑出酶活较高的1~10号克隆子进行摇瓶发酵验证。
这10个克隆子的胞外α-淀粉酶活性检测结果见图4。
根据摇瓶验证结果，将1号、2号、3号、5号、7号、8号这6个酶活相对较高的克隆子送测序。将测序结果在NCBI网站上进行Blast比对，确定每个克隆子所对应的信号肽。
1号信号肽为aprE；2号没有连接信号肽，载体与基因直接连接；3号和5号信号肽为YfhK；7号和8号测序结果相同，但没有找到对应的信号肽名称。
根据与枯草芽孢杆菌173种胞外分泌信号肽序列比对推测其可能是信号肽AspB缺失突变导致的，暂且称之为AspB'。
分别将信号肽aprE、无信号肽、YfhK、AspB'替换重组表达载体pHY300PLK-pfa上的原始信号肽amyE，并将正确构建的4种重组质粒转化到表达宿主菌。
摇瓶发酵培养，发酵步骤同上。发酵结束后，对发酵上清液进行α-淀粉酶的活性检测。其中，以信号肽AspB'引导分泌表达的酶活最高，为119.01U/mL；其次是以信号肽YfhK引导分泌的，酶活为63.76U/mL。
伴侣蛋白基因共表达在上述信号肽筛选的基础上，选择最优信号肽AspB'，构建带有信号肽AspB'且共表达伴侣蛋白PrsA的重组菌。
将带有信号肽AspB’的超高温α-淀粉酶基因pfa片段连接到表达载体pHY300PLK-PrsA/pfa上。
在载体上有3个HindⅢ酶切位点，采用限制性内切酶HindⅢ酶切质粒pHY300PLK-PrsA/pfa，得到大小分别为6000bp、2000bp和1600bp的3条条带。
将成功构建的pHY300PLK-PrsA/pfa重组表达载体WS9-AspB'PFA和WS9-AspB'PFA/PrsA同时进行发酵培养60h，同样发酵培养条件下WS9-AspB'PFA/PrsA胞外酶活为134.15U/mL，进一步提高了12.72%。
SDS-PAGE电泳检测结果显示，发酵上清液与破壁上清液的目的蛋白条带较浅，在破壁沉淀中，目的蛋白条带较明显。目的蛋白仍有部分未充分正确折叠的中间状态存在于破壁沉淀中，有进一步研究的价值。
在对重组菌株WS9-AspB'PFA/PrsA产超高温α-淀粉酶摇瓶发酵时间进行摸索过程中发现，该菌株发酵潜力较好，在不补料的情况下，在发酵60~310h时间范围内，酶活持续增加，摇瓶发酵310h，胞外酶活可达938.35U/mL。
不同pH对重组超高温α-淀粉酶的影响把酶液加到含有不同的pH(4.5~7.0)缓冲液和可溶性淀粉溶液的体系里，于100℃温度下，利用DNS法测定α-淀粉酶酶活。
这个pH值范围包涵了淀粉液化所需pH。结果显示，PFA的最适反应pH值为5.0，在pH值为4.5~6.5范围内相对酶活不低于80%。
不同温度对重组超高温α-淀粉酶的影响在相同的反应体系中，酶反应在不同的温度(40℃~100℃)条件下进行，探究不同温度对超高温α-淀粉酶的影响。重组PFA在100℃条件下反应，能够更好地催化可溶性淀粉的降解，酶活最高。
重组超高温α-淀粉酶的pH稳定性了解重组超高温α-淀粉酶的pH稳定性有助于该酶的保存。用不同的pH缓冲液(4.5~7.0)稀释酶液，在4℃条件下放置24h，测定酶活的变化。
在pH值4.5~7.0条件下放置24h，重组PFA的相对酶活都高于60%，在pH值6.0~7.0范围内，该酶稳定性最好。
重组超高温α-淀粉酶的温度稳定性重组PFA在90℃、100℃、110℃下的热稳定测定结果表明，在90℃、100℃条件下处理4h，仍然有50%以上的酶活。在110℃条件下，该酶的半衰期约为1h。
讨论沈微(2003)在大肠杆菌中重组表达，酶活达11.4U/mL。袁林等(2018)在枯草芽孢杆菌中重组表达，酶活达715U/mL。
Wang等(2016)在解淀粉芽孢杆菌中重组表达，胞外酶活达2000U/mL。韦宇拓等(2005)在毕赤酵母中重组表达，酶活达220U/L。
信号肽AspB'能够在表达宿主中高效介导超高温α-淀粉酶的胞外可溶性表达。
AspB'是一种新的信号肽，只有9个氨基酸组成(MKLAITAKA)，推测是由信号肽AspB(MK-LAKRVSALTPSTTLAITAKA)缺失了中间的13个氨基酸导致突变产生。
在后续实验中，利用基因突变的方式将信号肽AspB'核苷酸序列恢复为完整的信号肽AspB核苷酸序列，由它引导分泌到细胞外的酶活较AspB'引导分泌到细胞外的酶活降低20.61%。
这种在筛选过程中产生的信号肽自身突变可以有效提高目的蛋白的表达，这为获得最优信号肽提供了一种新的研究方法。
共表达伴侣蛋白PrsA的重组菌胞外酶活进一步提高12.72%，达到134.15U/mL。随着发酵时间的延长，促进分泌作用更加明显，发酵310h，胞外酶活可达938.35U/mL。
虽然没有达到现有异源宿主表达的最高水平，但是后续可以对重组菌进行进一步改造、发酵优化等来提高表达量。
从蛋白电泳的结果看，胞内仍有未正确折叠的蛋白，有进一步研究价值。枯草芽孢杆菌中表达的重组PFA酶学性质研究显示，最适反应pH值为5.0，最适反应温度为100℃。
100℃处理4h，PFA仍然保留60%的酶活。与之前文献报道的酶学性质基本一致。这对推动淀粉制糖工艺的产业化具有重要意义。
