编译：微科盟雨，编辑：微科盟景行、江舜尧。
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导读
镉（Cd）毒性严重限制了植物的生长发育。此外，蔬菜、水果和粮食作物中的镉积累对动物和人类的健康构成威胁。虽然植物的根细胞壁与Cd胁迫有关，但细胞壁多糖与Cd的结合是否有助于对Cd的耐受性仍然存在争议，而且细胞壁多糖生物合成在Cd胁迫下的转录调控机制尚不清楚。本研究对拟南芥NAC型转录因子NAC102进行了功能表征，揭示了其在Cd胁迫响应中的作用。Cd胁迫快速诱导编码NAC102的主要转录物的积累，特别是在根端。与野生型（WT）植物相比，NAC102突变体表现出增强的Cd敏感性，而过表达的植物表现出相反的表型。NAC102定位于细胞核，直接结合WALL-ASSOCIATEDKINASE-LIKEPROTEIN11（WAKL11）启动子并诱导转录，从而促进果胶降解并减少果胶与Cd的结合。此外，WAKL11过表达将NAC102突变体的Cd耐受性恢复到WT水平，这与较低的果胶含量和较低的果胶结合Cd水平相关。综上所述，本研究表明，NAC102-WAKL11模块调节细胞壁果胶代谢和Cd结合，从而赋予拟南芥Cd耐受性。
论文ID
原名：ThetranscriptionfactorNAC102conferscadmiumtolerancebyregulatingWAKL11expressionandcellwallpectinmetabolisminArabidopsis
译名：转录因子NAC102通过调节拟南芥中的WAKL11表达和细胞壁果胶代谢来赋予镉耐受性
期刊：JournalofIntegrativePlantBiology
IF：11.4
发表时间：2023年8月
通讯作者：吴玉环，陈微微
DOI号：10.1111/
实验设计
结果
1NAC102与Cd耐受性有关
为了确定Cd胁迫反应的关键基因，研究人员使用了反向遗传学方法，筛选拟南芥T-DNA插入突变体的Cd敏感性。发现了一个突变系SALK_030702，与对照条件相比，在含有50μmol/LCdCl2的培养基上生长时，其初生根明显变短，根系生物量明显减少（图1A-D）。为了测试这种T-DNA突变系是否对Cd敏感，研究人员在五分之一强度的Hoagland营养液中水培Col-0（野生型（WT））和突变幼苗4周，然后单独对植物进行相同的营养溶液（-Cd，对照）或含有30μmol/LCdCl2（+Cd）4天。在没有Cd的情况下，Col-0与突变系SALK_030702在根和芽的初级根长或新鲜生物量方面没有明显差异。相比之下，与WT相比，Cd处理的突变植物具有较短的初级根，产生的生物量更少，这表明突变体的Cd敏感性更高（图1E-H）。
图1.NAC102与镉（Cd）抗性有关。（A-D）Cd胁迫下的Cd敏感性表型（A）、初级根生长（B）、地上部鲜重（C）和根鲜重（D）。将Col-0植株（野生型（WT））、突变体NAC102（SALK_030702）、两个独立的NAC102过表达系（NAC102-OE1和NAC102-OE2）和两个独立的互补系（COM1和COM2）转移到提供0或50μmol/LCdCl2的1/5Hoagland溶液中4d，然后拍摄表型，并测量了主根的长度。为了测量芽和根的鲜重，收集20个幼苗作为样品，然后分离成芽和根。（E-H）Cd胁迫下突变体NAC102和WT的敏感表型（E）、根长（F）、地上部鲜重（G）和根鲜重（H）。WT和突变NAC102的四周龄拟南芥幼苗暴露于-Cd或+Cd培养基4天。（I）两个NAC102转录本（）和（）的示意图。图中显示了用于区分两种NAC102转录本的定量聚合酶链反应引物的位置。（J）正常条件下和在7天龄WT幼苗根和芽中的表达。插图具有不同的Y轴刻度，显示了芽中的低水平。ACTIN2被用作内部控制。（A）比例尺1cm，（C）比例尺2厘米。数据是SD±平均值（面板（B）中的n=20，（C，D）n=6，（F-H）n=7，（J）n=3），不同的字母表示不同处理在P≤0.05时存在显著差异。
查看拟南芥生物资源中心（ABRC）提供的公共信息，发现在编码NAC102的At5g63790的第二个外显子中插入了两个T-DNA拷贝（图S1A）。研究人员没有在SALK_030702纯合子系中检测到主要剪接形式的全长转录本（图S1B），表明在该突变体中被敲除（以下命名为NAC102）。尽管At5g63790被注释为具有两种转录本亚型，但通过逆转录定量聚合酶链反应（RT-qPCR）确定（）的丰度分别比根和芽中（）的丰度高约480倍和25倍（图1I，J）。此外，转录本在根部比在芽中更丰富（图1J）。因此，认为是编码功能性NAC102的主要转录本亚型。
为了探索NAC102对Cd耐受性的贡献，在NAC102突变体背景中生成了两条互补系，分别名为COM1和COM2。因此，研究人员引入了::转基因，该转基因由NAC102启动子组成，驱动绿色荧光蛋白（GFP）序列内和上游克隆的NAC102的表达（图S1A-C）。在正常生长条件（-Cd）下，观察到WT，NAC102突变体和两个COM系的根伸长率没有显著差异。在Cd胁迫下，测量到NAC102的初级根伸长抑制接近70%，但在WT和COM系中只有40%的抑制（图1A，B）。这表明NAC102确实负责在NAC102突变体中观察到的Cd敏感性。研究人员还生成了两个具有稳定过表达（OE）的转基因系，分别命名为NAC102-OE1和NAC102-OE2（图S1A-C）。在正常条件下，观察到WT和这些NAC102-OE系之间的根系生长没有差异；值得注意的是，NAC102-OE系在Cd处理时具有比WT更长的初级根（图1A，B）。这些结果与拟南芥的Cd耐受性中的NAC102有关。
2NAC102通过减少根Cd积累来赋予Cd耐受性
研究人员检查了WT，NAC102突变体，NAC102-OE系和COM系的Cd含量。在第一种方法中，使用Cd特异性荧光探针LeadmiumGreen目视观察根系中Cd的积累。与在没有Cd的情况下看到的低背景绿色荧光相反，在WT特别是NAC102突变根的Cd处理后，铅绿信号强度显著增加（图2A）。荧光强度的定量证实了与WT和两个COM系相比，NAC102中的信号要高得多，同时揭示了两个NAC102-OE系在所有测试的基因型中具有最低的荧光信号（图2B）。
图2.的突变导致镉（Cd）在Cd胁迫下根。（A，B）中的镉（Cd）积累，Cd特异性荧光（A）和根系中的相对信号强度（B）。将7天生野生型（WT）、突变型NAC102、NAC102-OE（过表达）系和1cm根长的互补（COM）系置于含有50μmol/LCdCl2的1/5Hoagland溶液中4d。使用Cd特异性荧光探针LeadmiumGreen检测Cd在根系中的分布。（A）比例尺-200μm。（C,D）Cd在根中（C）和芽（D）中的含量。（E）根系共质体和共质体Cd含量。WT、NAC102、NAC102-OE系和COM系的四周龄幼苗被转移到-Cd或+Cd条件下。经过4d处理后，收获根和芽用于电感耦合等离子体发射光谱（ICP-OES）的Cd分析。表示±SD（n=10表示Cd荧光强度，n=6表示Cd含量）。在图（C，D）中，表明在所有测试的基因型中，在正常条件下，根或芽中的Cd含量几乎检测不到；在图（B-D）中，不同的字母表示处理之间的显著差异，P≤0.05，而在图（E）中，星号表示与WT对照相比有显著差（*P≤0.05；**P≤0.01；***P≤0.001）。
在互补和更定量的方法中，研究者通过电感耦合等离子体发射光谱（ICP-OES）测量了4周龄植物中的Cd含量。与用铅绿获得的荧光强度一致，NAC102突变根的Cd含量最高，两个NAC102-OE系的Cd含量最低。值得注意的是，大部分Cd积累在根系中，占这些植物总Cd含量的90%以上（图2C），而所有基因型的地上部Cd含量没有显著差异（图2D）。研究人员得出结论，NAC102似乎通过引起Cd在植物根系中的积累来赋予Cd耐受性。
有人认为，细胞壁提供了防止Cd进入的物理屏障，这促使测量根部质外体与共质体中的Cd含量。与较高的根系总Cd含量一致，根共质体中的Cd水平远高于根部质外体。与WT和COM系相比，NAC102突变体在共质体和根部质外体中积累的Cd比其他基因型多，而两个NAC102-OE系在两个区室中表现出最低的Cd水平（图2E）。
由于NAC102表达水平与Cd含量呈负相关，尽管共质体中的Cd含量远高于质外体，研究人员通过进行时程实验来分析Cd在这两个位置的积累，从而研究了NAC102通过共质体还是质外体调节Cd积累（图S2）。研究人员测量到在Cd处理3d后的不同基因型（NAC102，WT，NAC102-OE）之间共质体的Cd含量没有差异；然而，NAC102突变体在第一天的共质体Cd含量高于WT植株，并且随着时间的推移，差异变得更加明显。到Cd处理的第二天，两个NAC102-OE系的共质体Cd积累明显少于WT。因此，NAC102优先影响拟南芥根系共质体Cd的积累。
3细胞壁果胶赋予NAC102介导的Cd耐受性
根共质体中Cd积累的增加促使研究细胞壁多糖的组成，据报道，这些多糖与Cd耐受性有关。虽然观察到在没有Cd的情况下，基因型之间的根果胶含量没有差异，但研究人员注意到在Cd胁迫下所有基因型的根果胶含量显著增加，NAC102突变体积累的果胶比WT多35%，而两个NAC102-OE系在所有基因型中果胶水平最低（图3A）。检测到任何基因型根部的半纤维素hemicellulose1（HC1），HC2或纤维素含量没有差异，无论Cd状态如何（图3B，3C，S3A）。此外，随着Cd浓度的增加，根细胞壁果胶积累更多（图S4），表明根果胶积累受到Cd胁迫的影响。值得注意的是，不同细胞壁组分中的Cd含量与其多糖含量一致。在果胶部分，NAC102突变体的Cd含量最高，WT和COM系的Cd含量较低，两个NAC102-OE系的Cd含量最低（图3D）。在HC1和HC2部分，检测到基因型之间的Cd含量没有差异（图3E，F）；对于任何测试的基因型，也没有在纤维素部分检测到任何Cd（图S3B）。
图3.细胞壁果胶有助于介导的镉（Cd）耐受性。（A-C）果胶含量（A），半纤维素hemicellulose1（HC1）含量（B），和半纤维素hemicellulose2（HC2）含量（C），在Cd胁迫下根系细胞壁。（D-F）Cd胁迫下果胶（D）、HC1（E）和HC2（F）中的Cd含量。野生型（WT）、突变型NAC102、NAC102-OE（过表达）系和（互补）COM系的4周龄幼苗在-Cd或+Cd条件下生长4d。数据是SD±平均值（n=6）。在P≤0.05的水平上，不同字母的条形在基因型之间存在显著差异。
4在Cd胁迫下对根有诱导作用，对茎无诱导作用
为了检查的组织特异性表达模式，通过在β-葡萄糖醛酸酶（GUS）报告基因上游放置NAC102启动子（翻译起始位点的上游）来生成::GUS报告基因。在幼苗阶段，在根中检测到GUS信号，但在下胚轴或子叶中几乎没有（图4A），这与RT-qPCR分析一致，显示主要在根中表达（图1J）。暴露于Cd导致根部中GUS信号更强，但在地上组织中则未检测到（图4B）。在没有Cd的情况下，GUS活性在根尖较强，但在根顶端分生组织非常弱，而Cd胁迫显著增强了整个根系的GUS活性（图4A-D）。在生殖阶段，从::GUS报告基因测定中检测到根，莲座叶，茎生叶和花中的GUS信号，但未在长角果中检测到GUS信号（图S5A-E）。与此一致，RT-qPCR分析表明，在6周龄WT植物的根，叶和花中形成型表达（图S5F）。
图4.在镉胁迫下的表达模式分析。（A-D）::GUS在整个幼苗（A，B）和根顶端（C，D）中的表达分析。将7-d-龄的转基因拟南芥幼苗暴露于0或50μmol/LCdCl22h。（A，B）比例尺=1mm；（C，D）比例尺=200μm。（E）通过检测Cd应激诱导的绿色荧光信号来积累NAC102蛋白。用0或50μmol/LCdCl2处理7个互补（COM）系（::）10min，然后分析NAC102-GFP（绿色荧光蛋白）融合蛋白的荧光信号。GFP：GFP荧光；Merged：GFP/明场叠加。比例尺=50μm。（F）在不同时间响应Cd胁迫的根系中的时间依赖性表达。野生型（WT）4周龄幼苗在+Cd条件下生长0、1、3、6、9、12、24、48、72和96h。（G）Cd胁迫下拟南芥根系的剂量反应。将WT的4周龄幼苗暴露于0,10,30,50和100μmol/LCdCl2中96h。数据是SD±平均值（生物重复的n=3）。ACTIN2被用作内部控制。与0小时或0μmol/L对照相比，星号在P≤0.05时显著不同。
由于响应Cd的应激，的转录本丰度至少增加了两倍（图S6），检查了NAC102蛋白的丰度是否受Cd影响而变化。使用含有::转基因的COM系，通过检测根中的GFP信号来评估NAC102蛋白。与GUS测定一致，在正常条件下几乎没有可检测到GFP信号，但观察到Cd处理后GFP信号在细胞核内迅速积累（图4E）。
研究人员通过将幼苗转移到含有30μmol/LCd的培养基中的时间过程实验剖析了Cd胁迫对的转录调控；这表明表达是在暴露1小时后诱导的，在暴露24小时时达到峰值，随后下降（图4F）。然而，与0小时时间点相比，相对转录本水平在Cd处理96小时时仍然较高。剂量依赖性实验显示，随着Cd浓度的增加，转录本丰度逐渐增加（图4G）。这些结果表明，NAC102对调节根系Cd胁迫反应具有积极作用。
5核定位的NAC102结合到WAKL11启动子上并激活其转录
研究者通过瞬时表达本氏烟草叶片中的35S::构建体以及核标记构建体H2B-RFP，编码与红色荧光蛋白（RFP）融合的组蛋白H2B，研究了NAC102的亚细胞定位。来自NAC102-GFP的荧光信号与H2B-RFP的荧光信号基本重叠（图5A）。将相同的35S::构建体引入Col-0并获得稳定的转基因系；在所得幼苗的根尖中，观察到GFP荧光与细胞核中的4’，6-二脒基-2-苯基吲哚（DAPI）信号之间存在大量重叠（图5B）。
研究人员还评估了NAC102在酵母表达系统中的反式活化潜力。根据其功能域将预测的NAC102蛋白分成不同的片段，并克隆每个编码片段，质粒携带编码酵母（Saccharomycescerevisiae）GAL4TF的DNA结合结构域的序列，然后将所得构建体单独转化为酵母AH109。携带BDGAL4-NAC102（氨基酸aa1-313）、BDGAL4-NAC102（aa51-313）和BDGAL4-NAC102（aa175-313）的酵母细胞在缺乏组氨酸的缺陷型（SD）培养基上生长良好，而单独携带BDGAL4，BDGAL4-NAC102（aa1-50），BDGAL4-NAC102（aa51-174）和BDGAL4-NAC102（aa1-174）的细胞则没有（图5C）。这些结果表明，NAC102是一种核蛋白，其反式活化结构域位于其C末端区域（aa175-313）。
图5.在镉胁迫下的表达模式分析。（A,B）亚细胞定位。35S::构建体在具有核标志物组蛋白H2B-RFP（红色荧光蛋白）（A）的本氏烟草叶片中瞬时表达，或在转基因拟南芥植株中沿主根（B）具有4’,6-二脒基-2-苯基吲哚（DAPI）信号的组成型表达。白色箭头表示细胞核。DAPI，DAPI荧光；GFP，GFP荧光；RFP，红色荧光蛋白荧光；Merged：GFP/RFP或GFP/DAPI字段叠加。比例尺=50μm。（C）转录激活测定。的全长氨基酸序列被截断以产生六个片段，包括由全长互补DNA（II-VII）编码的片段，其中空的pGBKT7载体用作对照（I）。将重组载体单独引入酵母菌株AH109（携带GAL4响应性GAL1启动子和HIS3报告基因）中，并在不含His的合成缺陷培养基上在30℃下培养3d。NTR：N末端区域；NAMfamily：NAC域；CTR：C端区域。
之前的研究表明，NAC型铝Al响应aluminumresponsive1（VuNAR1），饭豆（Vignaumbellata）中的NACTF，调节VuWAK1表达，这有助于细胞壁果胶代谢和Al结合能力。壁相关激酶（WAKs）或WAK样激酶（WAKLs）是附着在细胞壁果胶上的受体样激酶，具有细胞质蛋白激酶结构域。因此，研究人员测试了NAC102是否可能通过调节WAK或WAKL基因的表达来影响果胶含量和根系中Cd的积累。值得注意的是，在拟南芥基因组中的五个WAK和22个WAKL基因中，RT-qPCR分析确定WAKL11的表达被WT中的Cd胁迫上调，并且在NAC102突变体中消除了这种诱导（表S1）。与RT-qPCR结果一致，Cd处理增强了WAKL11pro::GUS报告系中的根GUS活性，但在NAC102WAKL11pro::GUS报告系中这种增强不太明显（图6A）。值得注意的是，在Cd胁迫条件下，NAC102-OE系中WAKL11的表达更高（表S1）。这些结果表明，NAC102对WAKL11的转录诱导发生在Cd胁迫下。
为了检查NAC102是否与WAKL11启动子结合，研究人员进行了酵母单杂交测定。将WAKL11的2022bp启动子区域分成9个片段，A1至A9（图6B）。据报道，NACTF可以识别含有CGT（G/A）或CATG基序的DNA序列。在A1，A2和A3顺式作用元件中发现了CGTG基序，但在其他片段中没有。值得注意的是，在酵母杂交测定中，NAC102与A1强结合，但与A2或A3不结合。此外，NAC102还与缺乏CGTG顺式元件的A5、A6和A7片段结合，表明这些片段可能含有其他结合基序（图6C）。
图6.NAC102通过直接结合其启动子来激活细胞壁相关激酶样CELLWALL-ASSOCIATEDKINASE-LIKEPROTEI11（WAKL11）转录。（A）WAKL11pro::GUS在转基因拟南芥植物根系中的表达分析。将7天龄的WAKL11pro::GUS和NAC102WAKL11pro::GUS转基因幼苗暴露于-Cd或+Cd培养基24h。比例尺=200μm。（B）示意图显示用于构建酵母单杂交（Y1H）测定报告载体的WAKL11启动子片段（A1-A9）。标记了WAKL11启动子中已知NAC结合顺式元件的位置。（C）Y1H分析。将一对质粒pAbAi-WAKL11pro和引入酵母菌株Y1HGold中，并在不含Ura但含有200ng/mLAbAi的合成（SD）培养基上培养。（D）示意图显示WAKL11的基因组结构，以及NAC102与WAKL11启动子区域结合的染色质免疫沉淀-定量聚合酶链反应（ChIP-qPCR）分析。将野生型（WT）和互补型（COM）（::）转基因植株4周龄幼苗暴露于+Cd培养基24h，然后用于染色质DNA分离，然后用抗GFP（绿色荧光蛋白）抗体免疫沉淀。启动子片段A1、A5、A6和A7与上图相同。采用qPCR检测免疫沉淀剂中WAKL11启动子片段的富集情况，倍数富集表明转基因植株的免疫沉淀效率与WT植株的免疫沉淀效率标准化。星号表示与WT植物的显著差异（P≤0.05）。（E）瞬时转录活性测定。将WAKL11启动子片段A1、A5、A6和A7分别克隆到pGreenII0800-LUC（由35S微型启动子驱动的基于荧光素酶（LUC）的报告载体）中，并将的编码序列克隆到35S::pCAMBIA1300中。重组结构通过农杆菌渗入法在本氏烟草叶片中瞬时共表达，发光强度（每秒计数）由彩色比例尺表示。（F）电泳迁移率移位测定。合成了两个含有CGTG基序或突变TACA基序的单链生物素标记寡核苷酸探针。未标记的DNA片段被用作竞争。NAC102蛋白是从35S::NAC102-GFP转基因植物中提取的，具有稳定表达的NAC102-GFP融合蛋白。
为了独立测试NAC102与WAKL11启动子的结合，使用抗GFP抗体和Cd处理的COM转基因系进行了染色质免疫沉淀，然后进行qPCR（ChIP-qPCR）。ChIP-qPCR显示，与WT植物相比，WAKL11启动子片段A1和A7的相对富集度分别为5.5倍和1.6倍；然而，在沉淀染色质中没有检测到A5和A6片段的富集（图6D）。作为NAC102和WAKL11启动子之间相互作用的体内验证，研究人员进行了瞬时萤火虫荧光素酶（LUC）报告基因测定，将LUC置于上述四个启动子片段中的每一个的控制之下，并将每个LUC构建体与NAC102效应子构建体一起共浸润本氏烟（）（图6E）。研究人员没有检测到来自仅用LUC报告基因或效应子的LUC信号。相比之下，与NAC102和A1::LUC或NAC102和A7::LUC共浸润的叶片显示出强烈的发光信号，表明NAC102直接激活WAKL11转录，特别是通过与植物中的A1片段结合。
6WAKL11对NAC102的Cd耐受性调控具有上位性
由于WAKL11是NAC102的假定下游靶基因，研究人员评估了WAKL11在Cd耐受性中的作用。为此，研究人员通过成簇规则间隔短回文重复（CRISPR）/CRISPR相关核酸酶9（Cas9）介导的编辑为WAKL11生成了三个敲除突变体，并将这些突变体命名为wakl11-1，wakl11-2和wakl11-3（图S8A）。研究人员还生产了过表达WAKL11的转基因品系，并选择了三个独立的品系，其WAKL11表达水平比WT高约60倍：WAKL11-OE1、WAKL11-OE2和WAKL11-OE3（图S8B）。虽然所有三个wakl11突变体都显示出减少的初级根伸长，但WAKL11-OE系具有相反的表型（图S8C，D）。鉴于研究人员将NAC102突变体中果胶含量和Cd积累的变化归因于WAKL11表达的丧失（图3,6），研究人员假设果胶和Cd积累的变化反映了WAKL11表达的变化。事实上，与WT植物相比，wakl11突变体的根系果胶含量较高，但WAKL11-OE系的果胶含量较低（图S8E）。HC1和HC2含量均未受到WAKL11的影响（图S8F，G）。研究人员检测到wakl11突变体果胶中积累的Cd较多，但在WAKL11-OE系中积累较少，HC1或HC2级分中的Cd含量没有差异（图S8H-J）。
为了提供WAKL11与NAC102上位的遗传证据，研究人员通过遗传杂交生成了基因型wakl11NAC102（使用所有三个可用的wakl11等位基因）和NAC102WAKL11-OE（具有所有三个WAKL11-OE系）。wakl11NAC102双突变体表现出与NAC102突变体相同的Cd敏感性，因此比WT植物更敏感。然而，当WAKL11在NAC102背景中过度表达时，产生的nac10WAKL11-OE线的灵敏度恢复到WT水平（图7A，B），这意味着WAKL11作用于NAC102下游以调节Cd耐受性。与此一致，NAC102和wakl11NAC102突变体的根果胶含量及其结合的Cd含量相当，但高于暴露于Cd的WT（图7C，D）。相比之下，WT和NAC102WAKL11-OE系之间的果胶含量及其Cd含量确实存在差异（图7C，D），但半纤维素含量或其结合的Cd含量在不同基因型之间没有差异（图S9）。
图7.CELLWALL-OCIATEDKINASE-LIKEPROTEIN11(WAKL11)参与NAC102-介导的镉抗性。（A,B野生型（WT）植株、NAC102突变体和三个独立品系的NAC102wakl11双突变体以及NAC102WAKL11-OE（过表达）品系的镉敏感表型（A）和相对根伸长（B）。用0或50μmol/LCdCl2处理七天大、根长1cm的幼苗4d。(C、D）NAC102wakl11双突变体和NAC102WAKL11-OE株系根中细胞壁果胶含量及其镉保留率。在-Cd或+Cd条件下处理四周龄幼苗4d。数据归一化为-Cd条件下WT的数据（WT-Cd）。平均值±SD（主根生长为n=20，果胶和Cd含量为n=8），不同字母表示在P≤0.05时，处理或不处理Cd的基因型之间存在显著差异。(E)NAC102-WAKL11模块在拟南芥中调控镉胁迫响应作用的工作模型。在镉胁迫下，转录本被诱导并编码功能性NAC102蛋白，该蛋白能够直接与WAKL11启动子结合以激活其表达。WAKL11表达的增加有助于细胞壁果胶的降解，从而减少根中的镉积累并赋予根抗镉能力。请注意，由于半纤维素似乎与镉耐受性无关，因此为清晰起见，工作模型中不包含半纤维素。
讨论
NAC是植物特异性TF，在植物生长和胁迫反应中起着至关重要的作用。NAC102先前被报道对水涝引起的缺氧和高光强度有反应。过多的光照会导致过氧化物和其他有毒代谢物的积累，从而触发NAC102的SCARECROW-LIKE样14（SCL14）依赖性表达，以调节许多编码解毒酶的基因的表达。
据报道，NAC102也参与油菜素类固醇稳态。通过与ATAF1、ATAF2和生物钟相关1（CCA1）相互作用，NAC102调节编码细胞色素P450酶的两个基因的表达，BAS1（PHYB活化标记抑制因子1）和SOB7（PHYB-47的抑制因子），导致油菜素类固醇分解代谢。用油菜素内酯进行外源性处理下调NAC102表达，并且NAC102突变体对油菜素内酯部分不敏感。
本项研究中，研究人员提出NAC102调节拟南芥的Cd耐受性。首先，是编码功能性NAC102蛋白的主要转录本（图1I，J），由Cd迅速诱导（图4），特别是在根顶端（图4D），其在调节细胞分裂和伸长以及水和营养物质的摄取中起重要作用。其次，NAC102的功能丧失突变导致对Cd应激的敏感性更高（图1A-H），而的过表达具有相反的效果（图1A-D）。
事实上，研究人员证明了NAC102通过影响细胞壁果胶代谢来调节Cd耐受性；以下证据支持这一点。首先，共质体Cd优先积累在所有基因型中，但特别是在NAC102突变体中（图2E，S2），并且NAC102突变体的根在其细胞壁果胶中保留了更多的共质体Cd（图3），这表明NAC102在调节共质体Cd保留中起重要作用。其次，在互补系中看到的NAC102突变体的Cd敏感性的挽救伴随着根共质体中较低的Cd积累和较低的细胞壁果胶含量，导致果胶中的Cd积累较低（图2E，S2）。相反，的过表达导致果胶含量降低，Cd积累减少（图3）。这些结果表明，NAC102通过影响细胞壁果胶代谢来调节共质体Cd的积累。第三，WAKL11的相对转录水平在Cd胁迫下上升，但这种诱导在NAC102突变体中在很大程度上被阻断（图6A；表S1），表明NAC102在WAKL11的上游起作用。有趣的是，WAKL11的表达与细胞壁果胶代谢有关。WAKL11敲除突变体显示出增加的Cd敏感性，而过表达WAKL11的转基因系显示出增加的Cd耐受性（图S8A-D）。此外，WAKL11在NAC102突变体中的过表达使这些系的Cd敏感性几乎与WT植物的灵敏度相同（图7A，B）。WAKL11表达与Cd耐受性之间的正相关与细胞壁果胶含量的变化一致，但与细胞壁半纤维素含量的模式不一致（图7C，S8E-G，S9）。这些结果表明，NAC102通过调节WAKL11表达来影响细胞壁果胶代谢。
VunAR1是一种来自饭豆的NACTF，已被证明可以通过直接结合其启动子来调节VuWAK1的表达。同样，研究人员在这里确定，在拟南芥中，NAC102调节WAKL11转录，如NAC102与EMSA和ChIP-qPCR中的WAKL11启动子结合的发现所证明的那样（图6B-F）。此外，WAK/WAKL家族的成员先前已被证明对金属暴露具有转录反应。例如，WAK1是一种早期的Al响应基因，其过表达赋予拟南芥幼苗的铝（Al）耐受性。WAKL4被钠（Na+），钾（K+），铜（Cu2+），镍（Ni2+）和锌（Zn2+）转录激活。在这里，研究人员确定WAKL11表达是由Cd应力诱导的（图6A；表S1）。这意味着WAK/WAKL基因家族的成员响应各种胁迫而受到转录调节，尽管这种调节的分子机制在很大程度上仍然未知。在WAKL4启动子中插入T-DNA（其翻译起始密码子上游40bp）损害了Na+，K+，Cu2+和Zn2+对该基因的转录激活，但Ni2+则没有。但是，这种感应需要哪些组件是未知的。研究人员目前的发现，结合Lou等人先前的结果，表明NACTF家族成员充当一些WAK/WAKL家族成员的上游调节器。
然而，目前尚不清楚WAKL11如何调节细胞壁果胶代谢。Lou等人报告说，VuWAK1转录本丰度与细胞壁中果胶的代谢呈正相关。与WT相比，wak1突变体具有更多的果胶，过表达WAK1的转基因系具有较少的果胶，果胶含量与细胞壁果胶部分中的Al积累呈负相关。WAK/WAKL家族成员在其C末端包含细胞质Ser/Thr激酶结构域，在其N末端包含细胞外基序，包括表皮生长因子（EGF）重复序列，EGF2样结构域和Ca2+结合EGF结构域。实验证据表明，WAK与细胞壁果胶共价结合。因此，WAKL11可能与果胶密切相关，果胶有助于果胶代谢，WAKL11的敲除导致果胶在细胞壁中积累（图S8E）。
重要的是，研究人员在这项研究中观察到细胞壁Cd含量与Cd敏感性之间存在正相关关系。与研究人员的发现一致，葡萄糖或生长素的外源性应用通过增加细胞壁HC1部分中的Cd固定来提高Cd耐受性。相比之下，磷缺乏诱导果胶和半纤维素多糖的减少，这是导致Cd细胞壁固定减少的原因，有助于减轻拟南芥的Cd毒性。在水稻中，Cd诱导植物激素赤霉酸（GA）的积累，GA通过减少根细胞壁Cd固定来调节Cd耐受性。因此，细胞壁固定Cd在Cd耐受性中的作用仍然存在争议。
为了解释这些相互矛盾的结果，研究人员提出了以下模型。镉胁迫逐渐影响植物生长。根共质体是根首次暴露于Cd时的主要目标位点，随后Cd进入症状。因此，Cd胁迫会优先影响根共质体（图S2），导致根系生长（图1A-F）以及水分和养分吸收的抑制是合理的。一旦Cd进入症状并被运送到叶子上，它就会直接影响许多代谢途径，例如光合作用，从而间接影响枝条生长（图1G）。因此，从Cd毒性的进展来看，Cd吸附到细胞壁和细胞壁内首先会导致根系损伤。然而，一旦根部通过调节细胞壁代谢适应了Cd毒性，通过限制Cd向所有细胞和芽的运输，Cd在细胞壁内的保留将是有益的。此外，植物的Cd耐受性需要根和芽之间以及共质体和符号之间的协调。最近的一项研究支持了这一观点，其中NAC004被证明可以通过调节不同水平的Cd分布和解毒来赋予Cd耐受性。
总之，本研究证明了根细胞壁果胶中的Cd积累有助于抑制根系生长（图7E），这种毒性作用触发可能的Cd应激信号，诱导的表达。另一种可能性是Cd与细胞壁结合导致果胶积累，从而触发诱导。然后NAC102直接与WAKL11启动子结合以激活转录，这进一步有助于细胞壁果胶降解，从而减少根系中Cd的积累并赋予Cd抗性。
