一文读懂亲和层析标签技术

为了便于重组蛋白的分离纯化，在构建重组表达载体时给重组蛋白加上亲和纯化标签，可以通过亲和层析技术快速分离纯化重组表达的蛋白质。亲和层析利用待分离物质和它的特异性配体间具有特异的强亲和力，从而达到分离的目的。

将可特异性强结合的一对分子中的一方（称之为配基）以共价键形式与不溶性固相载体（基质）相连形成亲和吸附填料，当含混合组分的样品通过亲和吸附填料时，只有和填料上的配基分子有特异亲和力的物质，才能被填料吸附结合，无关组分随流动相流出。改变流动相组分，可将结合的亲和物洗脱下来。

具有专一亲和力的生物分子对主要有：抗原与抗体，DNA与互补DNA或RNA，酶与底物、激素与受体、维生素与特异结合蛋白、糖蛋白与植物凝集素、生物素与链霉亲和素等。亲和层析可用于纯化生物大分子、稀释液的浓缩、不稳定蛋白质的贮藏、分离核酸等。

亲和层析纯化的分离原理

目前已开发出的亲和标签按照分子量的差异，将其分成两类：一种是结合小分子配体或者蛋白的蛋白标签，如MBP标签，GST标签、GFP标签、FC标签、Halo标签等，这些标签的使用可以增加目标蛋白的溶解性，缺点是对于一些应用如结晶或生产抗体等，标签必须加以去除；另一种是识别固定化配体的短肽标签，如HA标签、Myc标签、Flag标签、His标签、Strep-tagII等，这一类标签一般不会干扰目标蛋白的生物活性，对于某些应用，小标签无需去除。短肽标签对于融合蛋白的三级结构和生物活性的影响取决于标签的位置和氨基酸组成。

下表列举了用于分离纯化的常见亲和标签。

用于分离纯化的常用亲和标签

亚氨基二乙酸（IDA）和次氮基三乙酸（NTA）与6xHis标签结合

His标签通常是由5-15个组氨酸组成，分子量极小，可插入在目的蛋白的C末端或N末端，是目前蛋白高通量纯化中使用最广泛的亲和纯化标签。

由于结合量高、成本低廉、高通用性、纯化条件温和、结合特异性高、多种上样条件可供选择，在变性和非变性条件下均不影响重组蛋白的亲和纯化等特点，His标签公认为是重组蛋白分离纯化的第一选择。

固定化金属离子亲和层析填料（IMAC）上的NTA或者IDA基团可以螯合过渡金属离子（如Cu、Zn、Ni、Co等），His标签融合蛋白通过其组氨酸的残基上的咪唑基团，可与Ni、Co等过渡金属离子形成配位键而选择性结合在金属离子上，这些金属离子能够用螯合配体（NTA，IDA）固定在层析介质上，因此带有His标签的蛋白在经过装配了金属离子的层析介质时可以选择性结合在介质上，而其他杂质蛋白则不能结合或仅能微弱结合。结合在介质上的His标签蛋白可以通过提高缓冲液中咪唑浓度进行竞争性洗脱，从而得到纯度较高的His标签蛋白。

然而，并不是所有的蛋白质都可以与His标签融合后，采用固定化金属离子亲和层析分离纯化。宿主蛋白中含有半胱氨酸及天然发生的组氨酸丰富区域，在固定化金属离子亲和层析时可能会导致其他蛋白的非特异性结合;目标蛋白含有金属离子，一般也不采用His标签与固定化金属离子亲和层析。

His标签重组表达纯化蛋白示意图

1.分子量小，只有0-0.84KDa，一般不影响目标蛋白的功能;

2.纯化的条件温和，His标签融合蛋白可以在非离子型表面活性剂存在的条件下或变性条件下纯化，前者在纯化疏水性强的蛋白得到应用，后者在纯化包涵体蛋白时特别有用，用高浓度的变性剂溶解后通过金属螯和亲和层析去除杂蛋白，使复性不受其它蛋白的干扰，或进行金属螯和亲和层析复性;

3.可用于蛋白质-蛋白质、蛋白质-DNA相互作用研究;

4.免疫原性相对较低，可将纯化的蛋白直接注射动物进行免疫制备抗体;

5.与细菌的转录翻译机制兼容，可应用于多种表达系统;

6.可以和其它的亲和标签一起构建双亲和标签。

GST标签蛋白纯化示意图

GST（谷胱甘肽S-转移酶）标签由211个氨基酸组成，分子量大小为26kDa，能与其特异性的底物还原型谷胱甘肽(GSH)结合，广泛应用于融合蛋白表达与分离纯化中。

用于GST标签蛋白纯化的亲和填料通过将还原型谷胱甘肽(GSH)与琼脂糖介质上的预活化基团偶联形成GST亲和填料。融合有GST标签的目标蛋白可以与琼脂糖介质上交联的还原型谷胱甘肽(GSH)配体发生特异性互补性结合，这种结合具有可逆性，可以在温和、非变性的条件下通过在缓冲液中加入还原型谷胱甘肽将GST标签蛋白洗脱下来，杂质在结合过程中流穿或通过结合缓冲液被洗脱去除，实现目的蛋白的分离。

GST标签可以在大肠杆菌和酵母菌等宿主细胞中表达，起到提高表达量的作用；GST可在一定程度上增大融合蛋白的可溶性，不仅促进了目标蛋白的正确折叠，提高了蛋白产量，而且有助于后续的蛋白纯化；GST标签可很好的保留融合蛋白的抗原性和生物活性，并可使用不同的蛋白酶方便去除。如果GST标签需要切除，包含PreScission蛋白酶识别位点、Thrombin识别位点或FactorXa识别位点的标签蛋白可以去除GST标签。

1.增加外源蛋白的可溶性;

2.可在不同的宿主中表达，适用范围广;

3.可用不同的蛋白酶很方便的去除;

4.很好的保留了蛋白的抗原性和生物活性，提高外源蛋白的稳定性;

5.高特异性，纯化方便且温和;

6.分子量较大，可能会影响蛋白的功能和下游实验。

MBP标签（麦芽糖结合蛋白）残基数346，由大肠杆菌K12的MBP基因编码，通常插入蛋白N端，通常在大肠杆菌中进行表达。

MBP可增加在细菌中过量表达的融合蛋白的溶解性，尤其对于难表达的真核蛋白、膜蛋白、病毒蛋白有很好的促溶表达能力。

MBP标签与直链淀粉树脂的麦芽糖的结合，通过竞争性洗脱的方式将重组蛋白洗脱，同时利用位点特异性蛋白酶将MBP标签切除。

结合的融合蛋白可用10mM麦芽糖在生理缓冲液中进行洗脱。结合亲和力在微摩尔范围。一些融合蛋白在0.2%TritonX-100或0.25%Tween20存在下不能有效结合，而其他融合蛋白则不受影响。缓冲条件为到8.5，盐浓度可高达1M，但不能使用变性剂。如果要去除MBP融合部分，可用位点特异性蛋白酶切除。

MBP标签可通过免疫分析很方便地检测。有必要用位点专一的蛋白酶切割标签，常用的内切酶有FactorXa、麦芽糖酶和肠激酶。

1.简单的亲和纯化即可实现；

2.增加蛋白表达量和蛋白稳定性；

3.促进蛋白的可溶性和正确折叠；

4.标签较大，对蛋白的结构和功能会有一定影响。

FLAG标签是由8个氨基酸(Asp-Tyr-Lys-Asp-Asp-Asp-Asp-Lys)组成的一个短肽，分子量很小，因而不会遮盖融合蛋白中其他的蛋白表位与结构域，也不会改变融合蛋白的功能、分泌或运输。

现已发展出了M1、M2和M5三种抗-Flag单克隆抗体，已广泛用于Flag标签重组蛋白的免疫吸附纯化，通过将抗-Flag单克隆抗体固定在填料基质上形成Flag标签亲和纯化填料。

利用Flag标签与抗-Flag单克隆抗体特异性结合的能力从而实现Flag标签蛋白的分离纯化。利用合成的Flag短肽竞争性洗脱结合在填料上的Flag标签重组蛋白，不会对重组蛋白的生物活性造成影响，并且纯化效率高。易被抗FLAG的抗体识别，这样就方便通过IP、IF、WesternBlot、ELISA等方法对含有FLAG的融合蛋白进行检测、鉴定。

Flag融合标签含有一个肠激酶切割位点，肠激酶可以识别该短肽C端的五个氨基酸(Asp-Asp-Asp-Asp-Lys)，通过肠激酶处理除去标签后即可获得天然的非融合蛋白质。

M1、M2和M5抗-Flag单克隆抗体作用特点比较

抗Flag标签单克隆抗体在蛋白纯化的应用

Strep-TagII工作原理示意图

Strep-tag技术开发的原理是众所周知的生物素（biotin）和抗生物素蛋白链菌素（streptavidin）之间的结合反应。为了将这种牢固的相互作用用于蛋白质纯化用途，研究者们发现需要一个肽，该肽与重组蛋白质融合后，能够结合在streptavidin的生物素结合口袋，从而作为纯化tag。

最后研究者们成功设计出一个只由8个氨基酸(Trp-Ser-His-Pro-Gln-Phe-Glu-Lys)构成的短序列并称之为Strep-tagII，它可以位于融合蛋白的任意一端。

为了优化结合属性，streptavidin也被设计成为Strep-Tactin。Strep-tagII对Strep-Tactin的结合亲和力比对streptavidin高将近100倍。

Strep-Tactin是最稳定的蛋白之一，其偶联至高度交联的4%琼脂糖微球上，可用于各种表达系统，包括杆状病毒、哺乳动物细胞、酵母和细菌中含有Strep-TagII标签蛋白纯化，同时该树脂也可用于TwinStrep-TagII标签纯化。Strep-tagII/Strep-Tactin系统现已成为最被广泛应用的亲和层析系统之一。

GFP和荧光团的带状表示

GFP蛋白是由238个氨基酸组成的多肽链构成，亚基分子量约为27kDa，野生型绿色荧光蛋白在395nm处有最大光吸收，能够吸收蓝光，当受到紫外线或者钙离子激活时，能够发出绿色荧光，最大发射峰为509nm。

GFP荧光蛋白的生色团的形成是没有物种特异性的，是不需要任何外源反应底物的。荧光的产生只需要在含有氧气的环境下，分子内的第67位的Gly的酰胺对第65位Ser上羧基的亲核攻击形成第5位碳原子咪唑基，第66位Tyr的α-2β键脱氢反应之后，导致芳香团与咪唑基结合，GFP分子就形成对羧基苯甲酸唑环酮生色团从而发光。

eGFP/eCFP/eYFP/mCherry分别是增强型绿色荧光蛋白/增强型黄绿色荧光蛋白/增强型黄绿色荧光蛋白/单体红色荧光蛋白,具有不同的激发波长发射波长，均由野生型荧光蛋白通过氨基酸突变和密码子优化而来。

就eGFP而言，相对于GFP，其荧光强度更强、荧光性质更稳定。同时载体中构建的Kozak序列使得含有eGFP的融合蛋白在真核表达系统中表达效率更高。

mCherry是从DsRed演化来的性能最好的一个单体红色荧光蛋白，可以和GFP系列荧光蛋白共用，实现多色标记体内、外实验表明，mCherry在N端和C端融合外源蛋白时，荧光蛋白活性和被融合的目标蛋白功能相互没有明显影响。

CBP（Calmodulin-bindingpeptide钙调蛋白结合肽，CBP）由26个氨基酸残基组成，有一定的促表达效果，但主要是可以用来做亲和纯化。将钙调蛋白偶联在琼脂糖凝胶介质上，能非常特异的纯化CBP融合蛋白，洗脱条件为温和的钙离子缓冲液。

CBD（Chitin-bindingdomain几丁质结合域，CBD）由51个氨基酸残基构成，有一定的促表达效果，但主要也是用来做融合蛋白的亲和纯化。将几丁质偶联在层析介质上就得到了CBD亲和层析介质。可以一步纯化CBD融合蛋白，然后用几丁质或其类似物溶液竞争洗脱就能将融合蛋白洗脱下来，洗脱条件也很温和。

O6-苯甲基鸟漂岭衍生物对SNAP-tag融合蛋白的共价标记

SNAP-Tag是新一代的蛋白标签技术，大小为22kDa，在很多常见表达系统中都能够良好表达。不仅专一性极高而且稳定，最大的优点是适用于多种环境下的蛋白质检测与纯化，如活细胞内、溶液中、或固态相(如SDS-PAGEgels)等。

SNAP-Tag是从人的O6-甲基鸟嘌呤-DNA甲基转移（O6-alkylguanine-DNA-alkyltransferase）获得。无论体内还是体外，SNAP-Tag都能与底物高特异性地共价结合，使蛋白标记上生物素或荧光基团（如荧光素和若丹明）。

SNAP所带的活性巯基位点接受了苯甲基鸟嘌呤所携带的侧链苯甲基基团，释放出了鸟嘌呤。这种新的硫醚键共价结合使SNAP所带的目的蛋白携带上了苯甲基基团所带的标记物。苯甲基鸟嘌呤在生化条件下稳定，并且没有其他蛋白会和这类物质作用，所以SNAP标签反应是高特异的。

SNAP-tag对于可以连接的化合物的性质，没有严格的限制，即SNAP-tag与苯甲基鸟嘌呤衍生物之间的结合反应不应受苯甲基鸟嘌呤是具有哪种“二级标签”的影响，因此，SNAP-tagTM可以有多种配体，从而轻松实现标记的多样性。

SNAP-tag可以应用于各种不同的研究，主要包括：可在活细胞或细胞提取物中快速标记融合蛋白；可将蛋白质共价固定于固相介质表面，而无需进行之前的纯化工作；可与蛋白酶配合，在把融合蛋白固定化后，纯化目的蛋白，捕获蛋白复合物；可直接在SDS-PAGE胶中检测SNAP-tagTM融合蛋白。

SNAP-tag应用范围

HaloTag标签原理

HaloTag标签蛋白是一种经基因工程改造、无催化活性的水解酶衍生物，HaloTag标签分子量为33KDa，可与HaloTag®配基（氯化烷烃配基）形成共价键(下图)。在生理条件下，此共价键会迅速形成，并具有高度特异性且基本不可逆，所形成的复合物即使在严格的条件下稳定性也很好。

HaloTag标签单体蛋白能融合在重组蛋白的N端或C端，并在原核和真核系统中表达。

HaloTag配基是小分子化学物，能够在体外或体内与HaloTag蛋白共价结合（区别于一般tag的非共价结合）。

这些配基由两个关键组分组成：

(1)一个通用的HaloTag反应联结子，结合HaloTag蛋白；

(2)一个功能基团,例如荧光染料或亲和媒介。

能够共价和特异性结合多种合成的报告基团和亲和配基的特性，使得HaloTag蛋白能够用于检测和亲和结合或固相化固定目的蛋白。

HaloTag不同配基示意图

HaloTag®配基=氯化烷烃+功能基团

•荧光配基：用于细胞成像,蛋白相互作用检测(BRET)。具有不同颜色的荧光基团。

•非荧光配基：用于蛋白检测,如：生物素Biotin,PEG-Biotin。

•表面配基：用于蛋白纯化,蛋白相互作用研究(Pull-down),如：磁珠,树脂。

•反应性配基：用于连接功能基团，如：正电子成像术(PET)配基，磁共振试剂。

生物素连接酶工作示意图

AviTag标签蛋白是一个15个氨基酸残基组成的短肽，具有一个单生物素化赖氨酸位点，与已知天然可生物素化序列完全不同，可以加在目标蛋白的N端和C端。融合表达后，可被生物素连接酶生物素化。生物素与亲和素/链霉亲和素具有很强的亲和力，两者的亲和常数甚至比抗原-抗体反应还要高10-100万倍，是目前已知强度最高的非共价作用，利用这一特性生物素标记蛋白可以应用于蛋白的固定、纯化和显影等。由于生物素标记的这些优势，AviTag™技术更是得到了广泛的应用。

1.无论在体外或者体内，几乎所有的蛋白都可以在一个独特的AviTag位点轻易且有效地被生物素化；

2.生物素化是通过酶和底物的反应来实现，反应条件相当温和而且标记的专一性极高；

3.生物素AviTag只有15个氨基酸，对蛋白空间结构的影响非常小。

Myc标签可插入蛋白的C端或N端，但由于Myc重组蛋白的低pH洗脱条件往往会降低蛋白活力，Myc标签很少用于蛋白纯化，更多应用在Western-blot杂交技术、免疫沉淀和流式细胞术中,可用于检测重组蛋白质在靶细胞中的表达。

但需要注意的是Myc标签蛋白本身即为人的Myc基因的一部分，所以应尽量避免将该蛋白应用于人的细胞或组织相关实验。

SUMO标签蛋白是一种小分子泛素样修饰蛋白（Smallubiquitin-likemodifier），是泛素(ubiquitin)类多肽链超家族的重要成员之一。在一级结构上，SUMO与泛素只有18%的同源性，然而两者的三级结构及其生物学功能却十分相似。

研究发现SUMO可以作为重组蛋白表达的融合标签和分子伴侣，不但可以进一步提高融合蛋白的表达量，且具有抗蛋白酶水解以及促进靶蛋白正确折叠，提高重组蛋白可溶性等功能。

此外SUMO还有一项重要的应用，就是可用于完整地切除标签蛋白，得到天然蛋白。因为SUMO蛋白水解酶能识别完整的SUMO标签蛋白序列，并能高效地把SUMO从融合蛋白上切割下来。切除SUMO后，经过亲和层析，去除标签蛋白部分，就得到和天然蛋白一样的重组蛋白。所以SUMO标签也常用于和其他标签一起应用，作为特异酶切水解位点。

FC标签是免疫球蛋白重链的恒定区（结构域3和4）。它与蛋白的C端融合，因此它在某种程度上类似于小鼠/人类嵌合抗体，有时FC融合蛋白也被称为FC嵌合蛋白。FC标签约为25kDa。

在蛋白上添加FC标签，不仅可以通过市售ELISA试剂盒快速简单地检测蛋白的表达，还可以用蛋白A、蛋白G和蛋白L亲和纯化填料对FC标签蛋白进行快速的亲和纯化。

此外，在蛋白中添加FC标签通常可增加蛋白溶解度和表达量。在某些应用中需要去除FC标签，如用于蛋白结晶。

FC标签重组蛋白可从细胞培养裂解液或上清液中直接亲和纯化。FC标签蛋白就像IgG抗体一样，与蛋白A、蛋白G或蛋白L亲和纯化树脂结合。在洗去残留的杂质后，结合的FC标签蛋白可以通过低pH的缓冲液从亲和柱洗脱。为了去除FC标签，需要在标签和蛋白之间设计一个蛋白酶裂解位点。在FC标签后面的EK裂解位点（FC-EK位点-蛋白结构）可以完全去除FC标签和裂解位点，且在FC标签的特异裂解后不留下任何额外的氨基酸。